大鼠模型是生物醫(yī)學(xué)研究中重要的資源，因與人類(lèi)免疫系統(tǒng)相似，而常被用于免疫相關(guān)的功能研究。然而目前小鼠模型在基礎(chǔ)和機(jī)制免疫學(xué)研究中占主導(dǎo)地位，相對(duì)缺乏對(duì)大鼠模型中免疫細(xì)胞的流式分析鑒定。本文將分享對(duì)大鼠常見(jiàn)免疫細(xì)胞的流式鑒定方案，鑒定分析不同組織中的粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞及NK細(xì)胞。

實(shí)驗(yàn)方案1

該方案以10-12周齡Lewis大鼠的肌肉、脾臟、胸腺和腸系膜淋巴結(jié)為樣本，組織經(jīng)消化并用40μm細(xì)胞過(guò)濾器過(guò)濾后制備成單細(xì)胞懸液。

配色Pannel：

圈門(mén)邏輯：

圈門(mén)分析：

1. 側(cè)向散射(SSC)和前向散射(FSC)參數(shù)對(duì)樣本細(xì)胞進(jìn)行圈門(mén)，利用FSC-H去除粘連細(xì)胞，然后進(jìn)行單一細(xì)胞圈門(mén)；采用死活染料及CD45對(duì)活性良好的CD45+細(xì)胞進(jìn)行下游分析；

2. 巨噬細(xì)胞：根據(jù)CD11B、CD68圈出巨噬細(xì)胞（CD11B⁺CD68⁺），再根據(jù)CD86和CD163分別圈出M1（CD86+）和M2（CD163+）型巨噬細(xì)胞；

3. 單核細(xì)胞：根據(jù)CD11B、CD43圈出單核細(xì)胞（CD11B⁺CD43⁺）；

4. 粒細(xì)胞：根據(jù)CD11B、CD43、CD62L圈出粒細(xì)胞（CD11B⁺CD43⁺CD62L^+/-SSC^hi），當(dāng)粒細(xì)胞被激活時(shí)CD62L則低表達(dá)；

5. 淋巴細(xì)胞：利用TCR?δ圈出?δT細(xì)胞，接著在TCR?δ-的細(xì)胞中，進(jìn)一步根據(jù)CD3劃分 T 細(xì)胞（CD3+）和非T（CD3-）淋巴細(xì)胞；

（1）T細(xì)胞：在CD3⁺T細(xì)胞中，根據(jù)CD4、CD8圈出CD4+和CD8+ T細(xì)胞;在CD4+T細(xì)胞中圈出Treg細(xì)胞（CD25+）、Th1細(xì)胞（CCR1⁺CCR5⁺）和的Th2細(xì)胞（CCR4⁺CCR8⁺）；

在CD3⁺T細(xì)胞中，在根據(jù)CD44和CD62L圈出激活性T細(xì)胞（CD44⁺CD62L^-）、記憶T細(xì)胞（CD44^hiCD62L^lo）、naive T細(xì)胞（CD44^loCD62L^hi）；

（2）B細(xì)胞：非T細(xì)胞淋巴細(xì)胞中，根據(jù)CD45R圈出B細(xì)胞（CD3^-CD45R⁺）；

（3）NK細(xì)胞：非T細(xì)胞淋巴細(xì)胞中，根據(jù)CD49b圈出NK細(xì)胞（CD3^-CD49b^-）。

實(shí)驗(yàn)方案2

該方案以Sprague-Dawley大鼠的血液和肺、脾臟、肝臟、骨髓細(xì)胞為樣本。

配色Pannel:

流式結(jié)果:

圈門(mén)分析:

1. 側(cè)向散射(SSC)和前向散射(FSC)參數(shù)對(duì)樣本細(xì)胞進(jìn)行圈門(mén),去除碎片(i)，利用死活染料去除死細(xì)胞(ii)，利用FSC-H和FSC-W參數(shù)來(lái)排除粘連細(xì)胞（iii），利用CD45圈出淋巴細(xì)胞（iv）；

2. T細(xì)胞：從CD45+細(xì)胞中，圈出CD3+T細(xì)胞（v)，根據(jù)CD4、CD8圈出CD4⁺T和CD8⁺ T細(xì)胞（vi）;

3. NK細(xì)胞；從CD45+CD3-的細(xì)胞中，圈出CD161⁺His48^-細(xì)胞（vii）；

4. B細(xì)胞：從CD45+CD3-CD161-His48+/-的細(xì)胞，圈出CD45R⁺CD161^-細(xì)胞（viii）；

5. 中性粒細(xì)胞：從CD45+CD3-CD161-CD45R-的細(xì)胞中，圈出CD43⁺細(xì)胞（ix）；

6. 單核細(xì)胞：從CD45+CD3-CD161-CD45R-CD43-/lo的細(xì)胞中，利用CD43和His48的差異表達(dá)圈出兩個(gè)單核細(xì)胞亞群 ——CD43^LoHis48^Hi 和 CD43^HiHis48^Lo-Int（x）。

總結(jié)

兩個(gè)方案為大鼠常見(jiàn)免疫細(xì)胞的鑒定分析提供了框架，但對(duì)一些細(xì)胞群的鑒定有所差異：方案1通過(guò)CD45+CD3-CD49B+鑒定NK細(xì)胞，方案2則通過(guò)CD45+CD3-CD163-鑒定NK細(xì)胞；方案1通過(guò)CD45+CD11B+CD43+鑒定單核細(xì)胞，而方案2通過(guò)CD43和His48將單核細(xì)胞分為兩群（CD45⁺CD3^-CD161^-CD45R^-CD43^-/loCD43^LoHis48^Hi 、 CD45⁺CD3^-CD161^-CD45R^-CD43^-/loCD43^HiHis48^Lo-Int），強(qiáng)調(diào)了CD43和His48指標(biāo)對(duì)中性粒和單核細(xì)胞鑒定中的實(shí)用性。

參考文獻(xiàn)：

[1]Adusei KM, Ngo TB, Alfonso AL, Lokwani R, DeStefano S, Karkanitsa M, Spathies J, Goldman SM, Dearth CL, Sadtler KN. Development of a High-Color Flow Cytometry Panel for Immunologic Analysis of Tissue Injury and Reconstruction in a Rat Model. Cells Tissues Organs. 2023;212(1):84-95.

[2]Barnett-Vanes A, Sharrock A, Birrell MA, Rankin S. A Single 9-Colour Flow Cytometric Method to Characterise Major Leukocyte Populations in the Rat: Validation in a Model of LPS-Induced Pulmonary Inflammation. PLoS One. 2016 Jan 14;11(1):e0142520.